试剂清单

购买的相关试剂（脂肪酶抑制剂相关）

试剂纯度品牌
Triton X-100生化试剂级上海阿拉丁化工有限公司
奥利司他纯度>97%上海阿拉丁化工有限公司
4-硝基苯月桂酸酯（pNPL）纯度>98%上海阿拉丁化工有限公司
猪胰腺脂肪酶2型sigma

脂肪酶抑制活性测试步骤

胰脂肪酶溶液——配置5ml

抑制剂溶液 —— 3个平行，4种中药，1个奥利司他

缓冲液 —— 配置25ml

p-PNL溶液——配置30ml

配置溶液：

（1）Tris-HCl 缓冲液配制：称取 (1.04544g) Tris 粉末溶解在85ml超纯水中，加入盐酸，调节 pH，再加水调至86.4ml，配备成 0.1 mol/L，pH 8.2 的缓冲液备用

（2）胰脂肪酶溶液的配制：称取70mg（0.070g）胰脂肪酶溶液融入14ml Tris-HCl（0.1 mol/L，pH 8.2）缓冲液中，配备成 5mg/mL 的酶溶液，3000 g 离nidengx心 10 分钟后取上清液后使用。

（3）1% Triton X-100 溶解醋酸钠溶液配制（0.41mg/mL, pH 5.0）：取 0.806 ml 的97%曲拉通 X-100，加入77ml超纯水。而后称取32.0mg（0.0320）醋酸钠加入其中，用盐酸调ph到5.0

（4）底物的配制：称取62.4 mg （0.062g）的 pNPL，溶于78ml 的含1% Triton X-100 溶解醋酸钠溶液，配备成 0.8 mg/mL 的底物溶液，沸水浴中加热 1 分钟助溶， 待冷却后使用。

（先配1mg/ml，再稀释10倍）

（5）抑制剂溶液的配制：将6.0mg( 0.0060g )冻干粉末(或奥利司他)先溶于0.6ml （600ul） DMSO，后溶于5.4ml超纯水（含 10%的 DMSO）中备用，而后再配置8.1ml超纯水+0.9ml DMSO溶液，吸取1mg/ml的溶液加入其中。配置成（0.1mg/ml）（浓度0.25mmol/L）的抑制剂溶液。

实验方法：

将 0.2mL 的胰脂肪酶溶液、0.2mL 的抑制剂溶液和 0.5 mL 的 Tris-HCl 缓冲液混合后放入 37°C的恒温培养箱中预热 10 分钟，之后加入 0.6mL 的 pNPL 底物溶液开始反应，反应 20 分钟后取出，随后在沸水浴终止反应 10 分钟， 取出样品在 3000 g 下离心 5 分钟后留上清液，并设置酶标仪为 405 nm ， 检测其吸光度值。实验空白组不含胰脂肪酶溶液，对照组不含抑制剂溶液，对照组、空白组不含抑制剂和胰脂肪酶溶液，奥利司他被用作阳性对照。反应体系按照表添加，实验需重复三次，根据方程式计算抑制率。

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