线虫 qPCR 全流程实操记录：从 RNA 提取到结果分析的完整操作

前言

本文记录了从线虫中提取 RNA、反转录生成 cDNA 到最终进行 RT-qPCR 的完整实验流程。内容包括不同组别线虫的收集清洗、RNA 提取步骤与纯度测定、反转录体系计算方法，以及 qPCR 的体系配置、引物使用与上机操作注意事项。该文章可作为日后重复实验的标准化参考，提高操作效率与结果稳定性。

本次实验设置3个组别，分别为“正常组”“2%葡萄糖造模组”“200μg/ml 余甘子水提物+2%葡萄糖治疗组”。每组共有5个90mm培养板的线虫。线虫数量如图所示

使用M9将线虫全部冲洗下来，反复清洗2次，确保线虫身上的细菌全部清洗干净。置于2ml 研磨管中，尽量吸取上清后备用。

随后使用提取RNA的试剂盒，本次实验用的是UElandy的试剂盒进行实验。

由于所使用的线虫组织量低于20mg，因此R-I、R-II（试剂盒内试剂）和异丙醇的用量都需要减半

往研磨管内添加 200μL的Buffer R-I，反复吹打。而后添加 75μL的Buffer R-I。加入完毕后，放入组织研磨仪进行研磨3分钟左右。

研磨完毕后，将研磨管放入离心机进行离心（12000g，5min）

取上清至试剂盒内提供的离心管。加入125μL的异丙醇进行备用（从这里开始，之后所有操作都需要用无酶枪头）。

而后按照图片中的步骤进行RNA提取工作：

文中所述的制备管与离心管的组合如下：

6A. 弃滤液，将制备管置回到2 mL离心管中，制备管中加500 μL Buffer W1A，12,000 x g离心 1 min。
7A. 弃滤液，将制备管置回到2 ml 离心管中，制备管中加700 μL Bufer W2，12,000 x g离心1 min; 以同样的方法再用700 μL Bufer W2洗涤一次。
8A. 弃滤液，将制备管置回到2 ml离心管中，12,000 x g离心1 min。
9A. 将制备管放入干净的1.5 ml离心管 (试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加70-100 Buffer TE(DNase & RNase-free)或RNase-free水。
10A. 室温静置1min， 12,000 x g 离心1min，洗脱得RNA。

注：此步RNA的保存需放入-80度冰箱

随后需要借助机器测定RNA的纯度

在测试之前，需要拿擦镜纸稍微擦干净探头，先拿Buffer Te当作空白组测定

随后按照自己的组别分别滴定测定，以上滴定都只需要1μL的液体

测定结果看A260/280，纯度在2.0 - 2.2是最好的

本次反转录为DNA同样也需要试剂盒，本次使用的为Tagara反转录cDNA

在这个体系中着重说明一下无酶水以及RNA样本的具体添加量的计算，在前段的体系中需要加入总体积为16μL的液体。根据前面测定RNA纯度所得的每个样本的RNA浓度（ng/μL）进行计算。

在这里以第一行的143.3 ng/μL为例子进行计算。计算需要多少微升（μL）的液体来获得 1 微克（μg）的物质。

四舍五入，则RNA样本处需要加7 μL的液体，那无酶水这一块就只需要加入7 μL就能满足液体总体积为16 μL的要求了。

添加完液体后，放入pcr运行即可。此时可放入4℃暂时进行保存。

做RT-qPCR所需要的试剂盒也是Takara的试剂盒：

本次做RT-qPCR所用的体系为，另外还需要准备内参F/R，目的基因引物F/R，以下是每个孔所需要加的试剂：

在正式实验之前，先用无酶水把引物溶解了，每个引物所要加入的量一般会写在离心管中：