RNA-seq的基本原理

一、概念

RNA-seq 是利用高通量测序技术对细胞或组织中 转录组（全部 RNA 分子集合） 进行测定的方法。它能揭示基因表达水平、转录本结构、可变剪接情况、新转录本等信息。相比于传统的 微阵列（microarray），RNA-seq 不依赖预先设计的探针，分辨率更高、动态范围更宽。

二、基本流程与原理

  1. RNA 提取
    • 从细胞或组织样本中提取总 RNA。
    • 常常会去除 rRNA（占比高达 80-90%），保留 mRNA 或其他关注的 RNA 类型（如 miRNA、lncRNA）。
  2. RNA → cDNA
    • 由于测序平台主要针对 DNA，需要先把 RNA 逆转录为 cDNA。
    • 通过 逆转录酶 合成一链或双链 cDNA。
  3. 文库构建
    • 将 cDNA 打断成合适长度的片段（通常 200–500 bp）。
    • 在片段两端连接 接头序列（adaptor），用于后续扩增和测序。
  4. 高通量测序
    • 常见平台：Illumina（短读长，覆盖率高）、PacBio、Nanopore（长读长，适合全长转录本）。
    • 测序得到大量的 reads（序列读段）。
  5. 数据分析
    • 基因表达分析 （1）基因表达定量（Count 值和 FPKM 值） （2）样本间皮尔逊相关性分析 （3）主成分分析（PCA） （4）基因表达分布（箱型图）
    • 差异基因分析 （1）Deseq2 差异基因分析、统计、筛选 （2）差异基因火山图 （3）差异基因聚类热图
    • 富集分析（包含模式物种和非模式物种） （1）GO 富集分析 （2）KEGG 富集分析
    • PPI 蛋白互作网络分析
    • GSEA 分析

数据分析

基因表达定量分析

Count值

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